1940年10月19日，国民党向八路军以及新四军致电，要求将在黄河南岸的八路军与新四军开赴到黄河北岸。11月9日，朱德、彭德怀、叶挺、项英均回电驳斥了这一无理的要求，不过为了顾全大局，最终还是让皖南新四军不对开赴号了黄河以北，不过蒋介石对此不予理睬，仍然是按着原计划密令第三战区的顾祝同与上官云相将江南新四军“解决”。
中共中央对形势发展的前途以及影响它的各种力量作出冷静的分析，提出打退国民党顽固派进攻的正确方针。要求江北部队暂时免调;对皖南方面，决定让步，答应北移。11月9日，中共中央以朱德、彭德怀、叶挺、项英名义复电何应钦、白崇禧(即“佳电”)，据实驳斥“皓电”的反共诬蔑和无理要求;同时表示，新四军驻皖南部队将开赴长江以北。12月8日，何应钦、白崇禧再电朱、彭、叶、项(即“齐电”)，要求迅即将黄河以南八路军、新四军全部调赴黄河以北。12月9日，蒋介石发布命令：长江以南的新四军于12月31日前开到长江以北地区;黄河以南的八路军、新四军于1941年1月30日前开到黄河以北地区。12月10日，他又密令第三战区司令长官顾祝同、第三十二集团军总司令上官云相等，调兵围歼新四军部队。
1941年1月4日，奉命北移的新四军军部及其所属皖南部队9000余人，从云岭驻地出发绕道北上。6日在安徽泾县茂林地区，突遭国民党军队七个师8万余人的包围袭击。新四军部队英勇奋战七昼夜，终因寡不敌众，弹尽粮绝，除约2000余人突出重围外，一部被打散，大部壮烈牺牲或被俘。军长叶挺在和国民党谈判时被扣押，政治部主任袁国平牺牲，副军长项英、参谋长周子昆在突围中被叛徒杀害。1月17日，蒋介石反诬新四军“叛变”，宣布取消新四军番号，声称将把叶挺交付“军法审判”。这就是震惊中外的皖南事变。这一事变是国民党顽固派发动的第二次反共高潮的最高峰。
中共中央提出在政治上取攻势、在军事上取守势，坚决击退国民党顽固派第二次反共高潮的正确方针。周恩来领导南方局在重庆，对国民党顽固派从政治上和宣传上进行了猛烈反击。周恩来为《新华日报》题写“为江南死国难者志哀!”“千古奇冤，江南一叶;同室操戈，相煎何急?!”的题词，对国民党顽固派进行了有力的声讨。中共中央军委还发布重建新四军军部，整编全军，继续坚持抗战。共产党的正义自卫立场，得到了各界人士、民主党派的同情和支持。国民党当局在政治上陷于空前孤立的形势下，不得不收敛其反共活动。1941年2月，蒋介石公开表示“以后再亦决无剿共的军事”。第二次反共高潮被打退。国民党顽固派制造皖南事变，惊醒和教育了对国民党抱有幻想的人们，孤立了自身。中国共产党的坚定立场和维护抗战大局的态度，赢得了多方面同情，扩大了群众影响，提高了政治地位。
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